(1)针对特定种属细胞优化的培养体系;
(2)多个方向诱导:成骨、成脂、成软骨、成肝、成神经元、成星形胶质、EB形成等;
(3)性能稳定,诱导分化效果好。
通常,我们在使用哺乳动物表达产生重组蛋白时不会遇到不溶性问题。大多数时候,哺乳动物细胞中产生的蛋白质是完全加工的分泌蛋白质,因此没有不溶性问题。对于困难蛋白质诸如膜蛋白,我们通常使用含有去污剂的商业试剂来裂解细胞以用于检测和定量目的。常规使用的标签包括His标签、Fc融合标签和Flag标签。
蛋白部原核系统去除内毒素有三个水平<1EU/µg(1000EU/mg)、<0.1EU/µg(100EU/mg)、 <0.01EU/µg(10EU/mg),1EU/mg较难做到,哺乳动物细胞表达系统做到1EU/mg容易一些,抗体可以做到0.5EU/mg,应用于小鼠的典型控内毒蛋白需求是<3 EU/mg,应用于人的典型控内毒蛋白需求是<1 EU/mg。哺乳动物细胞表达的内控标准是10EU/mg,但金斯瑞不默认检测内毒素含量,如果客户要求最终提供内毒素QC数据,如果客户有内毒素控制需求,需要在实验开始前提出。 通过控制试剂,容器以及表达纯化过程中的内毒素引入来控制内毒素水平。如果内毒素水平仍然较高,可以通过去内毒的柱子或是离子柱进一步去除。
一般采用Protein A或者Protein G纯化。
能提供亲和纯化,离子交换层析,疏水层析和分子筛层析。杂质大多是细胞内或培养基内的物质,可以通过层析技术去除。
一般对于含有亲和标签的蛋白,首选亲和层析后根据得到的蛋白纯度以及杂蛋白的位置性质,相应选择多步纯化的步骤。
(1)胰酶浓度:推荐胰酶使用浓度为0.25%-0.04%EDTA,使用之前需预热至37℃且pH值应维持在7.2左右。切忌消化过度(包括胰酶浓度过高、消化时间过长等),否则会导致细胞死亡、分化、状态变差,分化能力丢失等现象。细胞消化过程中需要在显微镜下观察细胞的消化程度,当看到大部分细胞变圆不贴壁,拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱落,此时应立即终止消化,若细胞仍有大部分贴壁,可适当延长消化时间以避免消化不彻底的情况出现。
(2)细胞的差异:不同种类的干细胞差异很大,特别是与肿瘤细胞株的差异更大,很多经验不可以直接使用,消化时需要仔细摸索最佳的时间。
(3)接种密度:干细胞传代过程中接种密度至关重要,如果太低会导致细胞增殖缓慢,甚至导致细胞老化,而细胞的老化是不可逆转的。一般细胞接种密度为20000个活细胞/cm2即50 0000个活细胞/T25,不同的干细胞接种密度会稍有差异,比如hMSC,我们推荐的传代接种比例为1:2。
培养基出现的絮状物是血清融解过程中所释出的蛋白,不同批次的培养基蛋白释出的情况也不同,属于正常现象。
细胞:细胞接收之后请检查干冰、细胞冷冻管是否有融化、解冻情形,若有请及时联系我公司销售人员。如不马上复苏必须立即置于液氮保存,保存时间可长达几年。
培养基:添加物和基础培养基按照标签所示温度分开保存时间为1年;混合之后必须避光保存在2-8℃,推荐在一个月内使用完。同时减少敞开盖子的时间,避免培养基pH变化导致使用效果不佳。
金斯瑞的蛋白服务能表达分子量10-250KD的蛋白(大肠杆菌系统:150KD;其它系统:250KD)。生产更大分子量的蛋白会越来越困难,因为分子量过大的蛋白在表达时极易降解或者表达困难。
抗原(蛋白)需要溶于PBS或者其他的不含有机溶剂的缓冲液中。抗原蛋白一般更偏向带小标签(如6xHis,HA,FLAG,V5,c-myc)。对于单克隆抗体的制备,要求蛋白抗原含量应大于2mg,纯度大于75%。用于诊断型或功能型单克隆抗体的开发的抗原,需要更高的纯度,一般需要85%-90%的纯度;对于多克隆抗体的制备,蛋白抗原含量应大于4mg,纯度大于85%(如需获得纯化的多克隆抗体,则请另外提供5mg抗原蛋白)。浓度一般要求>0.4mg/ml。